Kultury in vitro roślin wyp. lab

Kultury in vitro roślin wyp. lab, kultury in vitro

Kultury in vitro roślin

Wyposażenie laboratorium

Kultury in vitro

4. Trochę historii

u                 Totipotencja – jest to zdolność komórek zachowujących w organizmie dojrzałym charakter embrionalny do różnicowania się w różnego rodzaju komórki wyspecjalizowane w zależności od potrzeb organizmu albo też zdolność komórek dojrzałego organizmu do odróżnicowania się.

Trochę historii

u                 1839 rok – Schwan i Schleiden sformułowali teorię totipotencji komórek roślinnych, czyli zdolności odtwarzania całej rośliny z pojedynczej komórki.

Trochę historii

u                 Myśl tę podjął Gottlieb Haberlandt, austriacki botanik, którego zwykle uważa się za właściwego "ojca" roślinnych hodowli tkankowych.

u                 W 1898 r założył hodowle komórek izolowanych z miękiszu palisadowego, skórki i włosków epidermalnych kilku roślin (jasnoty purpurowej - Lamium purpureum i hiacynta wodnego - Eichornia crassipes, śniedka - Ornithogalum, miodunki - Pullmonaria mollissima).

Trochę historii

u                  Inkubował je na pożywce Knopa wzbogaconej sacharozą, asparaginą i peptonem.

u                  Obserwował wydłużanie się komórek palisadowych, zmiany ich kształtu, grubienie ścian komórkowych, pojawianie się skrobi w chloroplastach.

u                  Komórki pozostawały żywe przez kilka miesięcy, nie udało się jednak Haberlandtowi zmusić ich do podziałów.

u                  Wyniki tych pionierskich doświadczeń były więc niezbyt zachęcające, mimo to niezrażony badacz sformułował kilka hipotez - niezwykle śmiałych, inspirujących, a z dzisiejszej perspektywy wręcz proroczych.

Trochę historii

u                  Gottlieb Haberlandt zakładał że:

u                  izolowane komórki roślinne można będzie kiedyś utrzymywać w czystych hodowlach przez dowolnie długi czas;

u                  nawet komórki somatyczne (niegeneratywne) można będzie pobudzić do tworzenia zarodków i odtwarzania całych roślin;

u                  substancje pobudzające podziały zostaną otrzymane z tkanek merystematycznych i rozrodczych;

u                  hodowle komórkowe staną się ważnym narzędziem w badaniach rozwoju roślin.

Trochę historii

u                  Minęło sporo lat zanim zdołano doświadczalnie wykazać słuszność wszystkich tych założeń Gottlieba Haberlandta.

u                  Do 1939 r otrzymano stale rosnące, wieloletnie hodowle roślinnych komórek i korzeni.

u                  Prowadzono też hodowle in vitro niedojrzałych zarodków.

u                  Ogromny postęp w roślinnych kulturach in vitro nastąpił po drugiej wojnie światowej, w dużej mierze dzięki wyizolowaniu i scharakteryzowaniu fitohormonów.

Trochę historii

u                  Wtedy też stało się możliwe doświadczalne zademonstrowanie totipotencji pojedynczych komórek somatycznych, tj. ich zdolności do odtworzenia całego organizmu.

u                  Ta nadzwyczajna właściwość komórek, świadczy o tym, że każda (w zasadzie) komórka zawiera pełną informację genetyczną niezbędną do działania całego wielokomórkowego organizmu. Wykorzystuje się to praktycznie w metodach masowego rozmnażania roślin.

Trochę historii

u                 1902 rok – doświadczenia Haberlandta na izolowanych fragmentach roślin (włoski) i ich próba utrzymania przy życiu bez pozytywnych rezultatów.

u                 1922 rok – badania Knudsona nad asymbiotycznym kiełkowaniem nasion storczyków w kulturach in vitro.

Trochę historii

u                   1929 rok - hodowla zarodków lnu jako metoda ominięcia problemów wynikających z międzygatunkowego krzyżowania (Laibach)

u                   1934 rok – badania Whitea nad wzrostem korzeni pomidora w kulturach in vitro (pożywka zawierała glukozę i wyciąg z drożdży, eksplantaty przeszczepiano co pewien okres czasu utrzymując je w hodowli).

u                   1939 rok – badania Whitea, Gauthereta i Nobecourta na kulturach kalusa. Udało się utrzymać przy życiu ciągle rosnącą, niezorganizowaną masę komórek. Zastosowano auksynę w pożywce.

Trochę historii

u                   1941 rok – zastosowanie przez van Overbecka mleka kokosowego w pożywkach do hodowli Datura

u                   1946 rok – eksperymenty Balla na łubinie i nasturcji, w których po raz pierwszy udało się przeprowadzić regenerację całych roślin z wierzchołków pędów w kulturach in vitro.

u                   1948 rok – badania Skooga i Tsui nad ustaleniem odpowiedniego stosunku auksyn do adeniny co pozwoliło na ukształtowanie pędu i korzenia z kalusa tytoniu.

u                   1950 rok – otrzymanie przez Balla organów w kulturach kalusa Sequoia sempervirens.

u                   1952 rok – otrzymanie przez Morela i Martina bezwirusowych dalii z kultur merystemów wierzchołkowych

Trochę historii

u                   1954 rok – eksperymenty Muira i współpracowników, w których udało się zregenerować roślinę z pojedynczej komórki.

u                   1957 rok – badania Skooga i Millera nad kinetyną i jej rolą w procesach formowania pędu i korzenia w zależności od jej stosunku do auksyn.

u                   1958 rok – uzyskanie przez Stewarda prazarodków w kulturach zawiesinowych kalusa

u                   1959 roku – pierwszy podręcznik o kulturach in vitro tkanek roślinnych Gauthereta.

Trochę historii

u                    1960 rok - opracowanie prze Morela metody otrzymywania storczyków z kultur merystemów

u                    1965 rok – indukowanie kwitnienia w kulturach in vitro tytoniu pochodzącego z wycinków kwiatów (Aghion- Pratt).

u                    1966 rok – pierwsza roślina haploidalna otrzymana z ziaren pyłku (Guka i Mekeswari).

u                    1967 rok – Pierik indukuje zawiązywanie kwiatów w kalusie Lunaria annua (miesiącznica roczna) po przetrzymywaniu roślin macierzystych w niskiej temperaturze a Bourgin i Nitsch otrzymują haploidalne rośliny z ziarn pyłku.

u                    1969 rok – pierwsza izolacja protoplastów z kultur zawiesinowych (Erikson i Jonassek).

u                    1970 rok – pierwsza fuzja dwóch protoplastów przeprowadzona przez Powera i innych.

u                    1972 rok – krzyżowanie międzygatunkowe w wyniku fuzji protoplastów przeprowadzone przez Carlsona.

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych.
 

u                 Powinno ono się składać z następujących części:

u                 A) Pożywkarnia

u                 B) Pokój wagowy

u                 C) Myjnia

u                 D) Komora do szczepień

u                 E) Pokój lub komora hodowlana.

Schemat rozmieszczenia pomieszczeń

Wyposażenie laboratorium kultur in vitro

u                   1. Pożywkarnia

u                   2. Pokój zaplecza technicznego i wagowy

u                   3. Myjnia

u                   4. Pokój szczepień

u                   5. Pokój hodowlany

u                   6. Pokój hodowlany

u                   7. Szklarnia

u                   8. Tunel foliowy lub szklarnia

Wyposażenie pracowni kultur tkankowych

u                 Pożywkarnia

u                 miejsce gdzie przygotowuje się pożywki i naczynia.

Pożywkarnia

u                   Pożywkarnia – jest to miejsce, gdzie przygotowuje się pożywki i naczynia.

u                   Potrzebne są więc tutaj duże stoły , szafki z półkami na szkło laboratoryjne, szufladami na korki, kapsle, watę, narzędzia , recepturki, i inne drobne przedmioty.

u                   Na stole powinien być ustawiony pHmetr , mieszadło magnetyczne, łaźnia wodna i maszynka elektryczna.

u                   W tym pomieszczeniu powinna być także ustawiona lodówka w której przechowuje się odczynniki chemiczne, wymagające obniżonej temperatury oraz roztwory macierzyste do pożywek.

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

u                 Pokój wagowy – miejsce gdzie powinna się znajdować dokładna waga laboratoryjna na stabilnym stole.

Pokój wagowy.

u                   Pokój wagowy - obok pożywkarni powinien się znajdować pokój wagowy.

u                   Ważenie poszczególnych substancji wymaga dużej dokładności i powinno odbywać się w cichym , nie narażonym na wstrząsy pomieszczeniu. 

u                   Jeżeli brak jest odrębnego pokoju wagi można ustawić w pożywkarni w najbardziej stabilnym  miejscu, gdzie nie ma wahań temperatury i przeciągów.

Pokój wagowy.

u                  Waga laboratoryjna i waga techniczna powinny być ustawione na stole wagowym lub na innym stabilnym wypoziomowanym blacie.

u                  Obok powinno być miejsce na odstawianie odczynników i naczyń, które po skończonym ważeniu chowa się do podręcznej szafki, lodówki lub eksykatora  zgodnie z instrukcją na opakowaniu.

u                  W pomieszczeniu tym można także ustawić pHmetr.

Pokój wagowy

Wagi

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

u                 Myjnia – miejsce gdzie odbywa się składowanie i mycie wykorzystanego szkła laboratoryjnego.

Myjnia

u                   Myjnia – powinno się tu odbywać mycie szkła laboratoryjnego i likwidacja niepotrzebnych kultur.

u                   Tu może być także zlokalizowany autoklaw – urządzenie służące do sterylizacji pożywek pod ciśnieniem w parze o odpowiedniej temperaturze.

u                   Obok zlewu z jednej strony powinno być miejsce na brudne naczynia i szkło a drugiej strony powinna być umocowana tablica z kołkami do ociekania  lub stół ociekowy.

u                   Jeżeli pomieszczenie to jest dostatecznie duże powinna być tutaj także suszarka z wyłącznikiem czasowym co usprawnia pracę ponieważ można ją wykorzystywać wtedy po godzinach pracy.

Myjnia

u                 Można wyposażyć myjnie w maszynę do zmywania naczyń  lub myjnię laboratoryjną.

u                 Można wtedy zaprogramować mycie w zależności od stopnia zabrudzenia i uzyskiwać pożądany stopień ich czystości po umyciu.

u                 Dobrze jest jednak najpierw ręcznie umyć szkło w zlewach lub miednicach a dopiero potem włożyć do maszyny do zmywania.

Myjnia

u                   Zakażone kultury najlepiej wysterylizować przed otwarciem naczyń aby nie rozsiewać mikroorganizmów w laboratorium a więc po raz kolejny niezbędny jest autoklaw.

u                   Przestrzeganie czystości jest niezbędnym warunkiem przy pracy z kulturami in vitro.

u                   Tu może być także zlokalizowana destylarka.

u                   Woda destylowana jest niezbędna do przygotowania pożywek i innych roztworów  a także do płukania szkła laboratoryjnego.

u                   Niektórzy zalecają także użycie dejonizatora wody.

u                   Do przechowywania wody destylowanej powinny służyć specjalne , czyste, zamykane pojemniki.

Zmywarki

Sterylizacja

u                  Sterylizacja to proces technologiczny polegający na zniszczeniu wszystkich, zarówno wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych form mikroorganizmów.

u                  Prawidłowo wysterylizowany materiał jest jałowy - nie zawiera żadnych żywych drobnoustrojów oraz ich form przetrwalnikowych czy toksyn.

u                  Jedynie kontrolowany i powtarzalny proces sterylizacji jest procesem bezpiecznym.

 

Sterylizacja

u                   Sterylizacja w autoklawach jest zalecana przez wszystkie organy służby zdrowia, w tym przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) oraz Centrum Kontroli Chorób (CDS-USA).

u                   Polega ona na poddaniu materiałów wysokiej temperaturze pary wodnej o wysokim ciśnieniu w określonym czasie.

u                   Istnieją ustalone wartości tych parametrów, odpowiednie dla danego rodzaju narzędzi / materiałów.

u                   Zwykle stosuje się cykle o następujących minimalnych wartościach: 134oC przy ciśnieniu 2 bar w czasie 4 min. oraz 121oC przy 1,2 bar w czasie 15 minut.

 

Sterylizacja

u                   Norma Europejska EN 13060 dzieli autoklawy na trzy klasy sterylizacyjne:
 

u                   "B" - z frakcyjną próżnią wstępną , czyli kilkukrotnym odpompowaniem powietrza z komory autoklawu do wartości ciśnienia ok. -0,85 bar (względem atmosferycznego) i wtłoczeniem pary wodnej oraz z próżnią końcową zalecane przy sterylizacji materiałów porowatych, z zagłębieniami i pakietowanych.

u                   "S" - z jednorazową próżnią wstępną polegającą na wytworzeniu na chwilę przed cyklem podciśnienia o wartości -0,7 bar;

u                   "N" - autoklawy bez próżni lub bez suszenia.

Autoklaw

Wyposażenie laboratorium kultur tkankowych

u                 Komora do szczepień – jest to komora w której powietrze przepływa przez filtr, oczyszcza się z drobnoustrojów i jest kierowane w stronę osoby pracującej.

u                 Może to być miejsce wyjałowione lampami bakteriobójczymi.

Komora do szczepień

u                  Komora do szczepień. – komora do szczepień z laminarnym przepływem sterylnego powietrza jest urządzeniem dość drogim ale niezbędnym przy tego typu pracach.

u                  Powietrze oczyszcza się z zarodników, bakterii i pyłów przepływając przez system filtrów po czym jest kierowane w stronę osoby pracującej w komorze.

u                  W takiej komorze łatwiej jest  zachować warunki aseptyczne.

u                  Przed przystąpieniem do pracy należy dokładnie spryskać komorę, jej blat i narzędzia 70% etanolem.

Komora do szczepień

u                  Następnie narzędzia płucze się w wodzie destylowanej i osusza między złożonymi arkuszami bibuły.

...