Kultury in vitro rodzaje

Kultury in vitro rodzaje, kultury in vitro

u      Kultury in vitro

u      Rodzaje

u      Definicja

u      Kultury in vitro są to hodowle roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w jałowych warunkach.

u      Cele hodowli in vitro

u      Dlaczego hodujemy w warunkach in vitro:

u      uniezależnienie się od pory roku

u      określanie i regulowanie warunków hodowli,

u      selekcjonowanie linii o podwyższonej odporności na herbicydy, pestycydy i inne środki ochrony roślin, co jest znacznie tańsze niż selekcja w warunkach polowych,

u      badanie procesów fizjologicznych takich jak reakcja na stresy, komunikacja międzykomórkową, sekrecja różnych związków do środowiska.

u      otrzymywanie nowych, korzystnych dla człowieka genotypów roślin

u      Rodzaje kultur in vitro

u      Wyróżniamy następujące rodzaje kultur in vitro:

u      kultury kalusa,

u      kultury zawiesinowe (zawiesin komórkowych),

u      kultury pojedynczych komórek,

u      kultury protoplastów,

u      kultury pylników i mikrospor,

u      kultury zarodków,

u      kultury fragmentów roślin (organów roślinnych),

u      Rodzaje kultur in vitro ze względu na rodzaj użytego eksplantatu

u      Kalus

u      Kalus jest to stale dzieląca się, niezorganizowana tkanka mająca wygląd bezpostaciowej masy (np. tkanka przyranna).

u      Powstaje między innymi z kambium, rdzenia, łyka wtórnego, miękiszu drzewnego, i wielu innych tkanek.

u      Kalus

u      Kalus, kallus, merystem przyranny - tkanka roślinna powstająca w miejscu zranienia rośliny najczęściej z okolicznych komórek tkanki miękiszowej.

u      Jest to amorficzna masa komórek mająca zwykle postać białego nalotu.

u      Komórki tworzone przez te merystemy powodują stopniowe zabliźnianie się i zarastanie ran.

u      Komórki kallusa są zwykle większe od komórek tkanki macierzystej.

u      Kalus

u      Kalus stanowi bezkształtną masę niezróżnicowanych i szybko dzielących się komórek.

u      Może być wyprowadzony z prawie każdej tkanki roślinnej poprzez traktowanie jej mieszaniną hormonów roślinnych (auksyn i cytokinin w takim samym stężeniu).

u      Tak wytworzony kalus w zależności od warunków w jakich się będzie rozwijać (tj. stężenia hormonów) może ulec ponownemu zróżnicowaniu w kierunku pędów lub korzeni, włącznie z odtworzeniem całej rośliny.

u      Hodowle in vitro kalusa znajdują szerokie zastosowanie w badaniach nad fizjologią i genetyką roślin.

u      Kultury kalusa

u      Pożywka do wzrostu kalusa powinna zawierać sole mineralne, witaminy, aminokwasy, cukry i substancje wzrostowe.

u      Kalus ma wiele postaci różniących się wyglądem zewnętrznym, zwięzłością, budową komórek.

u      Utrzymanie jego ciągłego wzrostu w kulturach in vitro wymaga przeszczepiania go na świeżą pożywkę w stałych odstępach czasu.

u      Po pierwszych kilku przeszczepieniach duża część nowych kultur zamiera a następnie po dalszych przeszczepieniach ilość zamierających klonów zmniejsza się i ustala na stałym poziomie.

u      Dopiero wtedy możemy mówić o ustanowieniu trwałej hodowli tkanek kalusa.

u      Długotrwałe utrzymanie kalusa w kulturach in vitro zmienia często stopień ploidalności. Niekiedy pojawiają się fragmenty tkanek w kalusie (np. przewodzących). Zależy to głównie od stosunku auksyn do cukrów w pożywce.

u      Kultury kalusa

u      Gdzie stosować kultury kalusa

u      Kultury kalusa mogą być źródłem:

u      materiału do kultur zawiesinowych komórek i agregatów komórek,

u      komórek do kultur pojedynczych komórek,

u      komórek dla kultur protoplastów,

u      materiału do regeneracji innych organów i całej rośliny po umieszczeniu w odpowiednich warunkach.

u      Czym się charakteryzują kultury kalusa

u      Rośliny zregenerowane z kalusa wykazują często wiele cech odmiennych od rośliny macierzystej stąd nie wszystkie nadają się do masowego mnożenia.

u      Są one jednak przedmiotem badań genetycznych i hodowli mutacyjnej.

u      Czym się charakteryzują kultury kalusa

u      Z niektórych komórek wegetatywnych kalusa można doprowadzić do wytworzenia bez zapłodnienia niby zarodków (tzw. somatyczna embriogeneza) tylko dzięki doborowi odpowiednich ilości substancji wzrostowych i azotu mineralnego.

u      Kultury kalusa tkanek rakowych dostarczają materiału do badań porównawczych rozwoju komórek naroślowych (rakowych) i normalnych.

u      Kultury kalusa ułatwiają również badania pasożytów roślinnych i ich zależności od tkanek gospodarza.

u      Kultury zawiesinowe

Kultury zawiesinowe komórek umożliwiają badania wzrostu i różnicowania się. Można je również używać do zregenerowania całych roślin.

u      Możemy je podzielić na dwie grupy:

u      A. Kultury statyczne.

u      B. Kultury ciągłe

u      Kultury zawiesinowe

u      A. Kultury statyczne – są to takie kultury, które mają określony czas trwania, ponieważ po pewnym czasie składniki odżywcze w pożywce zostaną wyczerpane a zgromadzą się produkty przemiany materii komórek.

u      Kultury zawiesinowe statyczne – szybkość wzrostu komórek

u      Kultury zawiesinowe

u      B. Kultury ciągłe – są to takie kultury, które mają zapewniony przepływ nowej pożywki i stałe odbieranie narastającej ilości komórek.

u      Naczynie jest połączone odpowiednio z dopływem pożywki i powietrza.

u      Takie rozwiązanie umożliwia również pobieranie, co pewien czas próbek do badań bez wpływu na sterylność.

u      Zaletą tego systemu jest utrzymanie komórek w określonej fazie wzrostu, co pozwala na badanie wielu zjawisk fizjologicznych w badanej fazie.

u      Kultury zawiesinowe

u      Możemy wyróżnić 4 główne grupy metod utrzymywania statycznych kultur zawiesinowych:

u      a) Metoda wolnoobrotowa

u      b) Metoda wstrząsania

u      c) Metoda kultur wirowanych

u      d) Metoda kultur mieszanych

u      Kultury zawiesinowe

u      a) Metoda wolnoobrotowa – komórki kalusa są mieszane w specjalnym naczyniu z wyrostkami.

u      Naczynie jest umieszczone na płycie wolnoobracającej się.

u      Ruch płyty powoduje kąpanie się tkanek w ciągle napowietrzanej pożywce.

u      Kultura zawiesinowa komórek w naczyniu Stewarda

u      Kultury zawiesinowe

u      b) Metoda wstrząsania – kolby Erlenmayera umieszcza się na platformie obracającej się ze stałą prędkością 60-180 obrotów/ minutę.

u      Urządzenie mimośrodowe powoduje także wstrząsanie zawartości i przewietrzanie pożywki.

u      Kultury zawiesinowe na wstrząsarce mimośrodowej

u      Kultury zawiesinowe

u      c) Metoda kultur wirowanych – specjalny słój jest umieszczony na obracającej się ramie, która powoduje ruch wirowy naczynia.

u      Urządzenie jest lekko nachylone względem pionu, co zapewnia lepsze mieszanie się zawiesiny komórek.

u      Kultury zawiesinowe na  urządzeniu z wirującym słojem

u      Kultury zawiesinowe

u      d) Metoda kultur mieszanych – w tej metodzie samo naczynie tkwi w miejscu a mieszanie pożywki z zawiesiną komórek odbywa się za pomocą mieszadła magnetycznego wewnątrz naczynia szklanego.

u      Dzięki temu w tej metodzie możemy zastosować podgrzewanie zewnętrzne lub grzałkę wewnątrz zawiesiny.

u      Czym się charakteryzują kultury zawiesinowe

u      Obserwujemy w tych wszystkich metodach podobny rytm wzrostu komórek.

u      Początkowo komórki dzielą się wolno, najszybciej ulegają podziałom w 7 dniu po przeniesieniu do świeżej pożywki, a po 3 tygodniach podziały całkowicie ustają.

u      Trzeba więc wymienić pożywkę i zacząć namnażanie od początku

u      Kultury pojedynczych komórek

u      Metoda ta pozwala na otrzymanie klonu, pochodzącego od jednej, wyodrębnionej komórki, co umożliwia badanie morfogenezy w kulturach pochodzących z jednej komórki

u      Kultury pojedynczych komórek

u      Wyróżnia się tutaj następujące metody hodowli:

u      A) na „tratwie” z bibuły filtracyjnej

u      B) w wiszącej kropli

u      C) w mikrokamerze.

u      D) metoda płytek lanych.

u      Kultury pojedynczych komórek

u      Wyróżnia się tutaj następujące metody hodowli:

u      A) na „tratwie” z bibuły filtracyjnej – sterylne kwadraciki z bibuły filtracyjnej (8x8 mm) umieszcza się na wierzchołku kalusa, z którego będzie pobierana komórka.

u      Bibuła nasiąka roztworem pożywki i metabolitów kalusa.

u      Następnie na takiej aktywnej „tratwie” umieszcza się pojedynczą komórkę, która dzieli się i wytwarza kolonie nowych komórek

u      Hodowla pojedynczej komórki na „tratwie z bibuły” (1- tkanka macierzysta, 2-bibuła filtracyjna, 3- pojedyncza komórka i tworzący się kalus

u      Kultury pojedynczych komórek

u      B) w wiszącej kropli – pobieramy kroplę pożywki wraz z komórkami i umieszczamy je na szkiełku nakrywkowym od dołu.

u      W szkiełku przedmiotowym (podstawowym) robimy specjalne wyżłobienie, w które wejdzie pobrana kropla. Brzegi szkiełek uszczelniamy parafiną.

u      Kultury pojedynczych komórek

u      C) w mikrokamerze – kropla pożywki z komórkami umieszczana jest na szkiełku przedmiotowym (podstawowym).

u      Z boków a następnie z góry przykrywamy ja szkiełkami nakrywkowymi tworzącymi „mikrokamerę”.

u      Boki uszczelniamy parafiną.

u      Kultura pojedynczych komórek w mikrokamerze

u      Kultury pojedynczych komórek

u      D) metoda płytek lanych – z wyjściowej kultury zawiesinowej izoluje się pojedyncze komórki.

u      Pobraną mieszaninę wprowadza się do przestudzonego, ale płynnego jeszcze agaru i rozprowadza na szalce milimetrową warstwą.

u      W warstwie tej tworzą się kolonie.

u      Zalety kultur pojedynczych komórek

u      Kultury pojedynczych komórek pozwalają na:

u      a) badanie submikroskopowej struktury komórek,

u      b) badanie ich procesów życiowych (wzrostu, różnicowania, metabolizmu),

u      c) umożliwiają obserwację współzależności patogenów i żywicieli.

u      Protoplasty

u      Protoplasty roślinne
Protoplast jest to komórka roślinna pozbawiona ściany komórkowej.

u      Ściana usunięta zostaje za pomocą enzymów celulotitycznych oraz protelotycznych.

u      ...